PCR buffer基本組分

2024-11-25 一、buffer是干什么的？PCRbuffer（緩沖液）的作用就是給Taq酶提供一個最適的反應條件。一般含有Tris－HCL，Mgcl2+等成分。不同的pcrbuffer成分可能不一樣。二、buffer基本組分1、Tris-HCl：具有良好的緩沖能力和對多種酶的兼容性，在PCR中的主要作用是調節反應體系的pH值，使PCR反應過程維持在一個穩定的ph范圍內；為酶反應提供恒定的酸堿環境，保持酶的活性，確保PCR擴增的順利進行。2、K+：主要發揮穩定酶活性和參與模板DNA的解鏈作用...

如何降低非特異性擴增？

2024-11-25 一、擴增方式擴增方式一般有兩種，對稱擴增和不對稱擴增。1、對稱擴增使用等量的引物進行PCR擴增，擴增產物量隨著PCR循環呈指數增長，一般的PCR，使用的都是這種方式。由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR擴增的過程中會水解探針，導致探針被耗盡，無法用于熔曲分析；若使用抗酶切修飾的探針，可一定程度降低水解，但由于探針阻礙了聚合酶通過，擴增效率會大幅下降。對稱擴增產生的互補雙鏈，會與探針競爭結合靶序列，不利于探針結合到靶序列上，熔曲分析可能會出現異常。優點：靈敏...

病毒滴度的單位有哪些？

2024-11-22 一、病毒滴度病毒的滴度：單位體積(通常為mL)液體中具有生物活性的病毒顆粒數。滴度是一個病毒自身復制的數量概念，可分為物理滴度和感染滴度。物理滴度是指包含病毒基因組的病毒顆粒的濃度，可以通過通過定量PCR對病毒顆粒的基因組拷貝數進行檢測，也可以通過測定病毒顆粒中的特定蛋白進行定量，但物理滴度未考慮到病毒活性和感染效率，因此是不準確的。感染滴度是指成功轉導細胞的病毒顆粒的濃度，須通過細胞感染實驗來測定，如利用定量PCR對細胞中的病毒基因拷貝數進行檢測，或通過攜帶熒光的病毒感染細...

IHC染色不均勻分析

2024-11-22 上次我們分享了IHC未染色或無信號的原因分析，這次讓我們來看看IHC染色不均勻是為什么吧。一、組織切片制備解釋：組織切片薄厚不均勻→建議：更換刀片二、組織固定1.解釋：酒精固定不足會產生偽影；→建議：延長固定時間；嘗試不同的固定液2.解釋：固定延遲導致抗原擴散；建議：立即固定組織；可以考慮使用交聯固定劑三、脫蠟解釋：脫蠟不wan全→建議：使用新鮮的二甲苯四、抗體兼容性解釋：一抗可能結合其他抗原上的表位→建議：從多抗切換至單抗；嘗試不同的單抗五、透化解釋：細胞膜被破壞，膜蛋白丟...

IHC未染色或無信號原因分析

2024-11-21 IHC未染色或無信號的原因：一、?抗體問題?：抗體與一抗或二抗不兼容、抗體濃度不合適、抗體失效或儲存不當等都會導致無染色。例如，使用抗一抗種屬來源的二抗，確認二抗是否識別一抗的亞型；使用更高濃度的抗體或延長孵育時間；設置陽性對照，確保抗體仍然有效?。二、?抗原修復不足?：固定步驟可能會改變抗體識別的抗原表位，導致抗原修復不足。使用微波或壓力鍋進行抗原修復，確保使用新鮮配置的修復液?。三、?樣本處理不當?：樣本存放時間過長、切片制備不當（如脫蠟不ce底）、組織切片干片等都會影響...

蛋白芯片是什么？

2024-11-21 一、蛋白芯片簡介?蛋白芯片?是一種高通量的蛋白質功能分析檢測技術，主要用于監測蛋白質之間的相互作用。其基本原理是將各種蛋白質有序地固定于載體上，然后利用標記了特定熒光物質的抗體與芯片上的蛋白質結合，通過熒光強度分析蛋白質的表達數量和相互作用關系?。二、蛋白芯片的工作原理蛋白芯片通過將已知的蛋白質分子固定在固相載體上，然后捕獲與之特異性結合的待測蛋白質。這些待測蛋白質可能存在于血清、血漿、尿液等生物樣本中。通過洗滌和純化步驟后，利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術測定各點的熒光強度...

如何提取細胞核蛋白？

2024-11-20 本文介紹一下用勻漿器研磨法提取貼壁細胞核蛋白的具體操作。一、前期準備1、臺盼藍染液：取臺盼藍粉劑，將其溶解在10mL的雙蒸水當中配制成質量體積比為4%（4%w/v）的臺盼藍母液。在使用時，利用PBS緩沖液將母液稀釋10倍，使其濃度達到0.4%，之后再與細胞懸液混合均勻。2、BufferA：包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值為7.9）、1.5mmol/L的氯化鎂、10mmol/L的KCL、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）。若擔心漿蛋白降解會對核蛋白產生影響...

細胞凋亡的檢測

2024-11-19 一、光學顯微鏡觀察凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染，形成致密質塊，有時可碎裂。檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態改變，結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數。二、視頻時差顯微技術細胞培養中常用，通過相差顯微鏡可動態觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。檢測方法：收集2×10^5細胞/ml培養的細胞，置于多孔培養板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態改變，每隔1分鐘作序列攝影...